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崔元曦，田  宇，佟曉鳳，蘇  醒，華思銳，白素英*

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

論文摘要

B淋巴細(xì)胞瘤2基因相關(guān)啟動(dòng)子(Bcl-XL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)是麝鼠(Ondatra zibethicus)香腺miRNA測(cè)序篩選出的顯著差異miRNA靶基因之一。為了解麝鼠Bad基因的基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，探討其在麝鼠香腺發(fā)育和泌香中的作用，通過(guò)比對(duì)麝鼠的全基因組獲得麝鼠Bad基因的CDS區(qū)序列，并利用多種在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：麝鼠Bad基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)為615 bp，編碼204個(gè)氨基酸，編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為22 087.40、等電點(diǎn)為9.63、不穩(wěn)定系數(shù)為72.03、平均親水系數(shù)為-0.885，是不穩(wěn)定的親水蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽，有26個(gè)潛在的磷酸化結(jié)合位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該蛋白主要定位于線粒體。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(32.84%)、無(wú)規(guī)則卷曲(56.86%)、β-轉(zhuǎn)角(4.90%)和延伸鏈(5.39%)構(gòu)成。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示，麝鼠與倉(cāng)鼠科(Cricetidae)親緣關(guān)系最近，說(shuō)明Bad基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Bad蛋白與Bcl-2、Akt、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab等蛋白相互作用，提示Bad蛋白與這些蛋白間的相互作用可能促進(jìn)麝鼠香腺萎縮；與Mapk8等互作提示在香腺發(fā)育時(shí)具有抑制凋亡的作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究麝鼠Bad基因在香腺周期性發(fā)育中的功能提供參考。

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麝鼠(Ondatra zibethicus)原產(chǎn)自北美，是一種珍貴的毛皮動(dòng)物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，易于人工飼養(yǎng)。麝鼠食性較為廣泛，主要以新鮮的果實(shí)、蔬菜的塊莖為主，同時(shí)也食小魚、小蝦等水生小動(dòng)物。麝鼠又被稱為麝香鼠，是倉(cāng)鼠科（Cricetidae）中唯一會(huì)泌香的動(dòng)物。麝鼠中只有雄性的成年麝鼠可分泌麝鼠香，香腺形態(tài)和泌香過(guò)程在一年中從三月至十月呈現(xiàn)周期性變化。麝鼠香的主要成分為有機(jī)酸類物質(zhì)、醛類、烷類、酯類以及麝香酮、降香酮等環(huán)酮類物質(zhì)。這些成分與天然麝香成分相同，所以麝鼠香可被用來(lái)代替麝香，其成分中2%的麝香酮與天然麝香有著類似的藥理作用，通常被用于疾病的臨床治療，如抗炎鎮(zhèn)痛、降低血壓等。麝鼠香中大環(huán)酮類等物質(zhì)分子對(duì)接研究發(fā)掘出10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，展示出麝鼠香也可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)散等方面具有一定的藥用功效。

● 麝鼠（白素英 攝影）

B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動(dòng)子(Bcl-XL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)是Bcl-2(B-cell lymphoma-2，B淋巴細(xì)胞瘤-2）家族中促進(jìn)凋亡的主要基因之一。Bad基因編碼的產(chǎn)物與凋亡抑制基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，形成異源二聚體，與Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-2樣蛋白2 (Bcl-W)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，影響這些蛋白與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子(Bcl-2 associated X，Bax)的異二聚化水平，以此來(lái)達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的，從而發(fā)揮其促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞凋亡的生理作用。該蛋白在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于動(dòng)物的組織和器官中，可通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族成員作用而促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；谇捌谘芯肯阆賛iRNA測(cè)序，篩選出顯著差異的miRNA，Bad基因作為靶基因之一且為Bcl-2家族中關(guān)鍵基因，推測(cè)該基因可能與Bcl-2家族相關(guān)基因一樣參與調(diào)控香腺發(fā)育與泌香過(guò)程。因此，本研究基于生物信息學(xué)的方法分析麝鼠的Bad基因及其蛋白質(zhì)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征等，為該基因在麝鼠香腺周期性發(fā)育過(guò)程中的作用提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

生物信息學(xué)分析顯示：麝鼠Bad蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為2 2087.40，半衰期為30 h，等電點(diǎn)為9.63，是不穩(wěn)定的堿性親水性蛋白，由204個(gè)氨基酸組成。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。此外，麝鼠Bad蛋白有5個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和21個(gè)絲氨酸位點(diǎn)以及1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，這些氨基酸為該蛋白翻譯后潛在修飾位點(diǎn)。

●麝鼠Bad蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

A.   麝鼠Bad蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)；B.麝鼠Bad蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); C.麝鼠Bad蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè); D.麝鼠Bad蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); E.麝鼠Bad蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

序列比對(duì)顯示Bad蛋白比較保守。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，麝鼠與倉(cāng)鼠科物種親緣關(guān)系較近。

● 麝鼠與7個(gè)物種Bad蛋白氨基酸序列相似性

● 麝鼠Bad蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

與Bad相互作用的蛋白有Bcl-2、Akt1、Akt2、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab和Mapk8等。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，氨基酸從43~204為Bcl-2-Bad結(jié)構(gòu)域，含有Bcl-2的同源結(jié)構(gòu)域3(BH3)。

● 麝鼠Bad蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

A. 麝鼠Bad蛋白互作網(wǎng)絡(luò); B.麝鼠Bad蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

BH3結(jié)構(gòu)域：Bad蛋白的促凋亡作用主要依賴于BH3結(jié)構(gòu)域。去磷酸化時(shí)，通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2結(jié)合，釋放Bax形成同二聚體，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在有凋亡信號(hào)時(shí)，Bad在線粒體膜外發(fā)揮促凋亡作用。線粒體通路正是Bcl-2家族基因調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑的主要靶點(diǎn)。在麝鼠香腺發(fā)育周期中，Bcl-2和Bax的表達(dá)量變化影響香腺的發(fā)育和萎縮。Bad蛋白與Akt相互作用，參與細(xì)胞增殖、存活及代謝等功能的調(diào)節(jié)。Akt在麝鼠發(fā)育周期中隨著月份的遞增相對(duì)表達(dá)量下降。因此，推測(cè)在麝鼠香腺萎縮過(guò)程中Bad蛋白與Bcl-2、Akt、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab等蛋白相互作用促進(jìn)香腺細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致香腺逐漸萎縮。

Mapk8/JNK通路：JNK是磷酸化激酶，通過(guò)磷酸化修飾下游底物發(fā)揮功能?；罨腏NK對(duì)Bad蛋白蘇氨酸的201位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，可能具有抗凋亡作用。

14-3-3蛋白家族：Bad蛋白的絲氨酸第112位和第136位點(diǎn)磷酸化后，可與14-3-3蛋白結(jié)合，提高細(xì)胞存活可能性。暗示Bad蛋白在香腺發(fā)育過(guò)程中可能具有抑制凋亡的作用。

以上研究說(shuō)明，與不同蛋白互作Bad蛋白可能發(fā)揮不同的功能，產(chǎn)生不同的效應(yīng)。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步探究麝鼠Bad基因在香腺周期性發(fā)育中的功能提供參考。

● 第一作者簡(jiǎn)介：崔元曦（1998—），女，碩士研究生；主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail:1964634422@qq.com

● *通信作者：白素英，E-mail：baisynefu@qq.com